一、制備細胞生長培養(yǎng)基

所使用的培養(yǎng)基將取決于所使用的細胞類型。例如:

使用無菌技術(shù)在II級安全帽下工作。

二、在顯微鏡下檢查細胞

在生長過程中，應該每天檢查細胞，以確保它們健康并按預期生長。它們應該主要附著在燒瓶的底部，形狀圓而豐滿或細長，并在其膜周圍折射光線。這表明他們是健康的。

介質(zhì)應該是粉橙色。如果細胞大量分離和/或看起來干癟和顆粒狀/顏色深，則丟棄細胞，不要用于檢測。

三、制備細胞懸浮液

1. 所有細胞處理和培養(yǎng)基制備應在II類安全柜中使用無菌技術(shù)進行。

2. 當細胞融合70-80%時，它們?nèi)詰幱谏L的對數(shù)階段，可用于電鍍。

3. 首先將培養(yǎng)基在37°C水浴中加熱至少30分鐘。

4. 準備好后，小心地從一個175平方厘米的培養(yǎng)皿中倒入所需細胞的培養(yǎng)基（含有實驗室消毒劑），注意不要增加任何滴入的污染風險。

5. 立即更換，小心地倒入100毫升預熱好的新鮮培養(yǎng)基。

6. 使用細胞刮板，輕輕刮掉燒瓶底部的細胞到培養(yǎng)基中。有些細胞系可能需要胰蛋白酶化。在繼續(xù)之前，檢查燒瓶底部，檢查所有的細胞是否脫落。

7. 確保待計數(shù)的細胞懸浮液通過輕搖瓶混合均勻。必要時可使用血清學移液管。

8. 在細胞wan全有機會沉淀之前，使用血清學移液管取出約1ml細胞懸液，并將其放置在附注管中。

9. 用血細胞計進行細胞計數(shù)。

四、獲得正確的細胞密度

使用下面的計算得到正確的細胞密度。這應該是4.5 × 105個細胞/mL左右，但需要根據(jù)細胞系進行優(yōu)化。

N = df

45 × 104

N是每毫升細胞數(shù)

DF是計算出來的稀釋系數(shù)

由于細胞在100ml培養(yǎng)基中，接下來的計算是：

100 mL x稀釋因子

這將給出細胞應該在的介質(zhì)體積的值。

用血清學移液管加入適量的預熱培養(yǎng)基。

例子:

如果細胞計數(shù)為55 × 104/mL，有100 mL細胞懸液：

55 × 104細胞/mL = 1.22

45 × 104細胞/mL

100毫升× 1.22 = 122毫升

因此，對于45 × 104/mL的細胞懸浮液，在100 mL細胞懸浮液中加入22 mL預熱培養(yǎng)基。

如果正確細胞密度所需的體積小于100ml：

將細胞倒入50ml離心管中。

在離心機中以100轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)10分鐘，確保離心機平衡。

小心地倒出上清。

將細胞顆粒重懸于所需體積的預熱培養(yǎng)基中。

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