一、簡介

BeyoClick™ EdU-488細胞增殖檢測試劑盒(BeyoClick™ EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 488)，是一種基于DNA合成過程中胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine)類似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的摻入，并通過隨后的點擊反應(Click reaction)使EdU被Alexa Fluor 488所標記，從而實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏地檢測細胞增殖的試劑盒。

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本試劑盒可以檢測到細胞或組織樣品中單個的增殖細胞，同時也可以對細胞或組織樣品總體的細胞增殖情況進行定量檢測。本試劑盒可以檢測培養(yǎng)的細胞或組織樣品，也可以檢測組織切片。
經(jīng)本試劑盒處理后，增殖的細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)非常明亮的綠色熒光，可以用于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀或熒光酶標儀檢測，也可以用于高內涵篩選(High-Content Screening, HCS)。流式細胞儀或熒光酶標儀檢測僅適用于細胞樣品，不適用于組織切片。
細胞增殖能力的檢測是評估細胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。gong認的zui精確的檢測細胞增殖的方法是直接檢測細胞中DNA的合成。最初廣泛使用的通過檢測DNA合成來檢測細胞增殖的方法是放射性標記核苷摻入法，如氚標記胸腺嘧啶脫氧核苷([³H]thymidine)摻入法。但該方法由于有放射性污染并且很難實現(xiàn)單細胞檢測而受到很大的限制，隨后逐漸被基于抗體檢測的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步驟繁多，且需要使用BrdU抗體，影響因素較多，穩(wěn)定性比較差。并且由于BrdU法需要使用抗體，有時會和其它目的蛋白基于抗體的檢測相互產生干擾。EdU法基于EdU摻入和后續(xù)的點擊反應，無需使用抗體、操作便捷、檢測靈敏度高，是一種在BrdU法基礎上升級換代的新方法，將會逐步取代BrdU法。
MTT法(C0009)、WST-1法(C0035、C0036)、CCK-8法(C0037、C0038、C0039、C0040、0C0041、C0042、C0043、C0046)和CellTiter-Lumi™化學發(fā)光法(C0065、C0068)都是基于細胞活性的細胞增殖檢測方法，能檢測到細胞的總體增殖效果，但無法檢測到單個的增殖細胞。這幾種方法盡管都不是檢測DNA合成的，但被廣泛用于替代[³H]thymidine摻入法。CFDA SE法(C0051、C1031)基于細胞熒光示蹤的原理能檢測到單個的增殖細胞，但由于每增殖一次熒光減弱一半，在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細胞，檢測靈敏度不是很高，通常僅適用于流式細胞儀檢測。在進行科學研究時，上述這些基于細胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補充性檢測方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷，是一種新型胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine)類似物，EdU可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能與熒光標記的小分子疊氮化物探針(如Azide Alexa Fluor 488、Azide Alexa Fluor 555、Azide Alexa Fluor 594、Azide Alexa Fluor 647等)通過一價銅離子的催化發(fā)生共價反應，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應非常迅速，被稱作點擊反應(Click reaction)，其反應原理參見圖1。通過點擊反應，新合成的DNA會被相應的熒光探針所標記，從而可以使用適當?shù)臒晒鈾z測設備檢測到增殖的細胞。

圖1. BeyoClick™ EdU檢測法中的點擊反應(Click reaction)原理圖。熒光探針等標記的疊氮化物(Labeled Azide)與摻入到細胞DNA中的EdU，在銅離子的催化發(fā)生共價反應，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，最終使細胞DNA標記上熒光探針或其它探針。

二、優(yōu)勢

本試劑盒反應簡單、檢測靈敏度高。本試劑盒基于簡單高效的點擊反應，無需DNA變性，只需少量的小分子疊氮化物探針即可非常有效地標記出摻入的EdU，并且可以檢測到單個細胞的增殖情況。

本試劑盒使用便捷、兼容性好。本試劑盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使疊氮化物探針有效進入細胞并發(fā)生點擊反應，不會影響細胞形態(tài)，不會影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測，也不會影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測細胞周期、DAPI或Hoechst染料檢測細胞核)。而BrdU法為了使大分子的BrdU抗體進入細胞并與DNA上的BrdU結合，需要對雙鏈DNA進行變性處理(如酸變性、熱變性或者DNase消化等)，這種變性可能會影響細胞形態(tài)，影響后續(xù)的免疫熒光和免疫組化檢測、DNA的熒光染色等。BrdU法和BeyoClick™ EdU法檢測原理的比較參見圖2。

圖2. BrdU法和BeyoClick™ EdU法檢測原理的比較。A. BrdU法需使用大分子的BrdU抗體，由于空間位阻，雙鏈DNA須變性后才能使BrdU抗體與BrdU結合。B. EdU法使用小分子標記的疊氮化物(Azide)，無需DNA變性，操作更便捷，兼容性好，檢測結果更加穩(wěn)定可靠。

本試劑盒檢測快速，定性定量檢測都非常便捷。相對于至少需要4小時的BrdU法，本試劑盒采用的BeyoClick™ EdU法檢測新合成的DNA只需1.5-2小時，時間上大大縮短。本試劑盒同時提供了染色細胞核的Hoechst 33342，以方便染色觀察所有的細胞
核?？梢允褂脽晒怙@微鏡或流式細胞儀等進行定性和定量檢測。HeLa細胞用本試劑盒和熒光顯微鏡檢測細胞增殖的效果參見圖3；Jurkat細胞用本試劑盒和流式細胞儀檢測細胞增殖的效果參見圖4。

圖3. HeLa細胞用本試劑盒檢測細胞增殖的效果圖。無EdU組觀察不到綠色熒光(最左側一列)；EdU (10μM)孵育2小時組有明亮的綠色熒光(中間一列)；而用10mM的DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea)提前預處理0.5小時后，綠色熒光顯著減弱，說明DNA合成抑制后，EdU的摻入被顯著抑制(最右側一列)。

圖4. Jurkat細胞用本試劑盒標記后用流式細胞儀檢測細胞增殖的效果圖。Jurkat細胞只用EdU標記(左圖)，或在標記的同時用10mM的DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea)處理(右圖)，2小時后用本試劑盒進行點擊反應，然后用流式細胞儀進行檢測。從圖中可以看出，僅EdU標記的細胞有較高比例的綠色熒光(488 fluorescence)陽性細胞，呈現(xiàn)綠色熒光陰性(弱染色)和陽性(強染色)的兩個峰(左圖)，分別對應于未增殖細胞和增殖細胞。經(jīng)過羥基脲處理的細胞，綠色熒光陽性的細胞幾乎wanquan消失(右圖)，僅剩下一個綠色熒光陰性的峰(右圖)。該檢測結果說明DNA合成被抑制后，EdU的摻入也被抑制。實測數(shù)據(jù)可能會因細胞類型、細胞增殖情況、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本試劑盒小包裝C0071S如果用于培養(yǎng)的細胞(6孔板)的檢測，可以檢測50個樣品，每個樣品的反應體系為500μl的Click反應液；如果用于96孔板檢測，可以檢測500個樣品，每個樣品的檢測體系為50μl的Click反應液；如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板樣品的檢測，分別可以檢測125、250、350和1250個樣品，每個樣品推薦的Click反應液用量為200μl、100μl、70μl和20μl。小包裝如果用于流式細胞儀檢測，可以檢測50個樣品，每個細胞樣品的細胞數(shù)量宜為10-100萬，每個樣品的反應體系為500μl的Click反應液。小包裝如果用于冰凍或石蠟切片的檢測，可以檢測125-250個樣品， 每個樣品的反應體系為100-200μl的Click反應液。大包裝C0071L可檢測樣品的數(shù)量為小包裝C0071S的4倍。
三、包裝清單

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Azide 488和Hoechst 33342須避光保存。
注意事項：
Click Additive配制成溶液后請注意適當分裝。如果溶解后有白色物質析出，請上下顛倒多次，待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色，說明該組分的有效成分已失效，請棄用。

四、使用說明：
1.需要用戶自己準備的耗材和試劑
a.碧云天的PBS C0221A，或PBS (pH7.2-7.6)。
b.固定液(碧云天的免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)。
c.洗滌液(免疫染色封閉液P0102，QuickBlock™免疫染色封閉液P0260，或含3% BSA的PBS)。
d.通透液(碧云天的免疫染色強力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)。
e.去離子水或超純水。
f.根據(jù)實驗要求：18×18mm蓋玻片，6孔板或其它多孔板，或流式細胞分析儀用管子(如12×75mm)。
2.檢測體系的準備
a.如下以6孔板或常規(guī)切片檢測體系為例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，檢測體系可以相應按比例縮小。
b.如果檢測的是懸浮細胞，請按常規(guī)的懸浮細胞的操作方式進行。例如和貼壁細胞相比，相關步驟需要增加離心步驟等，如1000×g室溫離心5min。
3.培養(yǎng)細胞的EdU標記及固定、洗滌和通透
a.在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當數(shù)量的細胞。細胞培養(yǎng)過夜并且恢復到正常狀態(tài)后，進行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b.配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細胞類型、培養(yǎng)液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c.將37℃預熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設計終濃度為10μM，原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml，則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大，可以先吸除適量的培養(yǎng)液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM，例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d.繼續(xù)孵育細胞2小時。該孵育時間的長短取決于細胞生長速率，通常宜繼續(xù)孵育細胞周期10%左右的時間。對于常見的哺乳動物細胞如HeLa、3T3、HEK293等，細胞周期大約在18-25小時，孵育時間宜在2小時左右。人胚胎細胞的細胞周期約30分鐘，推薦的孵育時間為5分鐘；酵母細胞的細胞周期約3小時，推薦的孵育時間為20分鐘，增殖的神經(jīng)細胞其細胞周期約5天，推薦的孵育時間為1天。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20小時時，建議適當降低EdU的濃度。
e.EdU標記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1ml固定液(可以使用碧云天的免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。注：對于流式細胞儀檢測，貼壁細胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸后再固定。
f.去除固定液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞3次，每次3-5分鐘。
g.去除洗滌液，每孔用1ml通透液(可以使用碧云天的免疫染色強力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h.去除通透液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞1-2次，每次3-5分鐘。
i.轉步驟5。
4.動物體內EdU的標記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進食等適當方式進行動物的體內標記。如下以小鼠為例，其它動物體內EdU的標記請參考相關文獻。
a.對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關，可以參考相關文獻，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進行測試。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨購買碧云天的ST067。
b.4小時后或根據(jù)特定實驗確定的適當時間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標記的時間也可以參考相關文獻自行調整。
c.對于冰凍切片：
(a)加入適量固定液(可以使用碧云天的免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。
(b)去除固定液，用適量洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
(c)去除洗滌液，用適量通透液(可以使用碧云天的免疫染色強力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
(d)去除通透液，用適量洗滌液洗滌1-2次，每次3-5分鐘。
(e)抗原修復(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進行抗原修復，可以使用適當?shù)目乖迯鸵?，例如P0090冰凍切片快速抗原修復液(5X)，或者自行配制的適當?shù)目乖迯鸵哼M行抗原修復處理。
(f)轉步驟5。
d.對于石蠟切片：
(a)脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘，換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b)抗原修復(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫組化染色，可以使用適當?shù)目乖迯鸵?，例如P0081檸檬酸鈉抗原修復液(50X)、P0083改進型檸檬酸鈉抗原修復液(50X)、P0085 EDTA抗原修復液(50X)、P0086檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液(40X)、P0088通用型強力抗原修復液(10X)、P0092漂片抗原修復液(10X)，或者自行配制適當?shù)目乖迯鸵哼M行抗原修復處理。
特別注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進行抗原修復，必須反復洗滌干凈，否則殘留的酶會嚴重干擾后續(xù)標記反應。
(c)轉步驟5。
5.EdU檢測
注意：本步驟六孔板中每孔的反應體系為500μl的反應混合物。對于12、24、48、96和384孔板，每孔的反應的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應混合物。對于較小的孔，單位培養(yǎng)面積的液體用量已經(jīng)適當增加，以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來的負面影響。對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個切片使用100-200μl的反應混合物。如下以六孔板中的細胞樣品為例說明具體的操作方法，對于其它孔板或切片，僅每步溶液的用量按比例調整即可，其余方法相同。
a.配制Click Additive Solution：對于C0071S，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對于C0071L，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當分裝，并-20℃保存。
b.參考下表配制Click反應液。注意：請嚴格按照下表中組分順序和體積配制Click反應液，否則點擊反應可能無法有效進行；同時，Click反應液須在配制后15分鐘內使用。

c.去除上一步驟中的洗滌液。
d.每孔加入0.5ml Click反應液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品。
e.室溫避光孵育30分鐘。
f.吸除Click反應液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
g.如果需要對細胞核進行染色，可以參照步驟6進行。如無其它的特殊需要，即可在熒光顯微鏡下觀察，或者使用流式細胞儀、多功能酶標儀進行熒光檢測，或者用高內涵篩選儀器(一般高內涵篩選需要使用染料對細胞核進行染色)進行檢測。Azide 488的最大激發(fā)波長是495nm，最大發(fā)射波長是519nm。
6.細胞核染色
為了檢測細胞增殖的比例，可以考慮使用Hoechst 33342進行細胞核染色。一般高內涵篩選儀器也需要對細胞核進行染色。
a.1X Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀釋Hoechst 33342 (1000X)。
b.接上述步驟5g，吸除洗滌液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml，室溫避光孵育10分鐘。
c.吸除1X Hoechst 33342溶液。
d.用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
e.隨后即可進行熒光檢測。Hoechst 33342為藍色熒光，最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm。
7.流式細胞儀檢測
對于經(jīng)步驟5或6獲得的細胞懸液樣品進行流式檢測。如果使用傳統(tǒng)的流體動力學聚焦的流式細胞儀來測量總DNA含量，請在檢測過程中使用低流速，實驗中的每個樣品應使用相同的收集速率和細胞濃度。EdU標記產生的熒光信號一般使用對數(shù)刻度的橫坐標(如圖4中的橫坐標)。Azide 488的最大激發(fā)波長是495nm，最大發(fā)射波長是519nm。
注1：建議使用未經(jīng)EdU標記的細胞樣品作為流式細胞儀檢測的陰性對照，并選擇合適的電壓。
注2：由于流式細胞儀檢測比較靈敏，可根據(jù)細胞類型和實際染色情況對Azide 488的使用量進行適當調整。
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